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微生物产几丁质酶的研究概况及其应用

 2014-07-24 17:00:13 浏览量:0

摘 要:本文就产生丁质酶的微生物种类、生态分布,微生物几丁质酶的类型、酶学性质、作用机理及应用等方面的研究状况进行了综述。并且认为几丁质酶系的研究与开发在农业、工业、食品、医药等领域展现出良好前景。

关键词:微生物;几丁质酶;应用

几丁质(chitin)又称甲壳素或甲壳质,是真菌、甲壳类动物、昆虫、藻类等的重要结构物质,也是昆虫肠围食膜的重要成分,在自然界中储量仅次于纤维素,是第二大天然多糖[1]。它是通过β-1,4糖苷键将N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(N-acetylglucosam

摘 要:本文就产生几丁质酶的微生物种类、生态分布,微生物几丁质酶的类型、酶学性质、作用机理及应用等方面的研究状况进行了综述。并且认为几丁质酶系的研究与开发在农业、工业、食品、医药等领域展现出良好前景。

关键词:微生物;几丁质酶;应用

几丁质(chitin)又称甲壳素或甲壳质,是真菌、甲壳类动物、昆虫、藻类等的重要结构物质,也是昆虫肠围食膜的重要成分,在自然界中储量仅次于纤维素,是第二大天然多糖[1]。它是通过β-1,4糖苷键将N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,ANG)单元连接起来的长的直链聚合物,且有多种结构类型。细菌和真菌所分泌的几丁质酶(chitinase)可将β-1,4糖甘键水解,最终产物为N-乙酰-β-D-葡萄糖胺。几丁质也可经脱乙酰作用形成脱乙酰几丁质(Chitosan,或称聚葡萄糖胺),脱乙酰几丁质又可进一步被脱乙酰几丁质酶(Chitosanase)分解成氨基葡萄糖[2]。研究和利用几丁质酶(chitinase)降解几丁质从而进行病虫害防治、医药生产、饲料加工一直是人们关注的课题。

1 微生物产几丁质酶的研究概况

1905年,Beneck[3]首次分离到能够利用几丁质作为营养物质的微生物,定名为Bacillus chitinovirous(溶几丁质芽孢杆菌),但当时没有关于几丁质酶活性方面的直接证据。1921年,Folpmers[3]发现分解几丁质的细菌和放线菌在含几丁质的琼脂上形成透明圈,从而证明这些微生物内有水溶性的几丁质酶存在。此后,人们又相继从多种微生物(包括细菌、放线菌、真菌),多种植物及动物中分离到几丁质酶,并对几丁质酶的理化特性及生物学活性进行了大量的研究。目前,利用几丁质酶对真菌生长进行抑制成为研究热点,期望能将几丁质酶应用于生物防治,并进一步通过基因工程手段培育出抗真菌的转基因植物。

1.1 产几丁质酶的微生物种类[4]

(1)细菌:粘质沙雷氏菌,环状芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,斯氏假单孢菌,巨大芽孢杆菌,液化沙雷氏菌,液化肠杆菌,嗜水气单孢菌等等。

(2)放线菌:灰色链霉菌,红色链霉菌及其它一些未定种的链霉菌。

(3)真菌:溜曲霉,球孢白僵菌,米曲霉和木霉等。

1.2 产几丁质酶微生物的生态分布[5]

产几丁质酶的微生物分布广泛,细菌中G+和G-菌中许多都能产生几丁质酶。海洋、河湾、土壤中分布大量几丁质酶产生菌,一些海滩、海水、盐碱地、盐场、温泉是碱性几丁质酶产生菌的理想场所。如产碱性几丁质酶的菌株S.griseo fuscus S1001,就是从盐场中分离出来的。

1.3 微生物产几丁质酶的类型

按反应初级产物类型可分为内切几丁质酶和外切几丁质酶[6]。根据氨基酸序列的同源性,可将几丁质酶分成18家族和19家族两大类;按最适作用pH,可分为酸性、中性和碱性几丁质酶。

1.4 酶学性质

微生物产几丁质酶的分子量一般在19~110kD之间,不过有的可达到134759kD[2],大多数微生物的几丁质酶作用最适pH值在4~6之间,酶稳定的pH范围一般在4~11之间,等电点一般在pH3.6~8.6之间,作用的最适温度多为50~60℃,温度过高,酶活力容易丧失。金属离子如Ag+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、Sn2+等对几丁质酶活力都有不同程度的影响,有的离子能增强酶活性而有的却具有抑制作用。几丁质酶对底物具有一定的专一性,一般只可水解粉状几丁质、胶状几丁质、可溶性几丁质衍生物如乙二醇几丁质和二乙醇几丁,及可溶性的几丁三糖、四糖、戊糖和六糖等几丁质寡糖;不能水解麦芽糖、淀粉和纤维素等由几丁二糖经糖苷键连接而成的糖类。有的微生物如棉花黄萎病菌、金龟子绿僵菌和粘质沙雷氏杆菌产生的几丁质酶还能水解脱乙酰几丁质。

有些微生物在没有诱导物的情况下产生几丁质酶,但多数微生物只在含有几丁质等诱导物的培养基中才能产生几丁质酶[7]。几丁质酶基因的表达是受受体/诱导物系统所控制,一般以几丁质或其降解产物作为诱导物[8]。葡萄糖能抑制几乎所有微生物产生几丁质酶,说明几丁质酶基因的调控可能涉及分解代谢物的阻遏机制。

微生物所产的几丁质酶多是分泌型的,即在诱导物存在的条件下,微生物可以产生并向胞外分泌几丁质酶。该酶先在微生物的体外将几丁质分解,生成几丁单糖(NAG)或寡糖,这些糖再被微生物吸收和利用[9,10]。

1.5 几丁质酶作用机理

根据作用的部位,几丁质酶主要以内切和外切的形式作用于底物。内切是对几丁质糖链的任一部位进行随机水解,产生包括二糖在内的几丁质寡糖。外切是从多糖链的非还原性末端依次切下几丁质二糖(也有人认为是单糖)。纸层析分析表明,微生物的几丁质酶水解几丁质的产物绝大多数是二糖,属外切酶类,但也有报道皱链霉菌(Splicatus)的几丁质酶属于内切酶[11,12]。

2 微生物产几丁质酶的应用

2.1 几丁质酶降解产物的应用

几丁质酶降解几丁质,转化、产生菌体蛋白和氨基寡糖素等产物,在人类食品、医药、化妆及动物饲料等行业广泛应用[13]。此外,产几丁质酶微生物可用于对有壳水生动物废物的生物转换,因而可起到保护环境的作用。

2.2 在生物防治中的应用

几丁质是昆虫表皮和肠围食膜等几丁蛋白复合体的主要结构成分,同时还是真菌(除卵菌外)和一些藻类细胞壁的整合成分,但植物和脊椎动物中不存在。大多数几丁质酶生产菌对真菌具有拮抗作用,而且多数几丁质酶在离体情况下也能抑制真菌的生长。因此人们把几丁质酶看作是一个安全和具有较强选择性的杀虫剂靶标,这在几丁质酶的应用中有着重要的意义,同时人们开始进行将几丁质酶应用于生物防治的研究。 www.cnenzyme.com

2.2.1 用于植物病原真菌的生物防治

产几丁质酶的微生物能有效防治引起粮食、蔬菜发生病害的植物病原真菌,因此逐渐受到人们的重视。目前,在病害防治中已取得了令人鼓舞的成果,如用木霉菌防治蔬菜病害。国外已有商品化的木霉制剂问世,如美国的Topshield(哈茨木霉T 22)和以色列的Trichodex(哈茨木霉T39)[14,15]。

2.2.2 用于抗病基因工程

进入20世纪80年代,随着分子生物学的蓬勃发展,使几丁质酶用于生物防治的研究上升到基因工程水平。1984年Shapira[2]把几丁质酶基因从粘质沙雷氏菌(S.marcescens)克隆到E.coli后,被整合的E.coli和酶的提取液,在室温条件下均表现出对真菌的生物防治能力。1988年PhilliosW.等[8]将皱褶链霉菌(S.plicatus)的几丁质酶结构基因以pBR 322为载体转入到E.coli中,获得了成功的表达。继而,科学工作者采用植物基因工程技术,将几丁质酶在生物防治中的应用又向前推进了一步。1990年英国科学家通过土壤农杆菌将细菌的几丁质酶基因导入双子叶植物中,成功培育出表达该酶的转基因植物,此类植物可抑制病原真菌的侵袭,并对植物线虫、昆虫和其它一些病原生物也具有抗性。目前,通过此基因工程技术已获得的转基因植物有烟草、大豆、棉花、水稻和玉米。

2.3 在调节生命代谢活动中的应用

几丁质被几丁质酶降解后,可获得具有生物活性的寡糖片段--氨基寡糖素。氨基寡糖素在调节植物细胞生命代谢活动中起着非常重要的作用。它作为植物功能调节剂,调控植物基因的关闭和开放,诱导植物分泌抗性酶,不但可以调节植物生长,还可增强植物对病原真菌的抗性。在动物肠道中,氨基寡糖素还可调节微生物的代谢活动,改善肠道微生物种群分布,刺激有益于动物健康的微生物(如双歧杆菌)的生长,作为人体的功能性保健食品具有重要的开发价值。

总之,随着对微生物产几丁质酶理论研究的不断深入,几丁质酶应用范围的不断拓展,几丁质酶系统在农业、工业、食品乃至药物中的应用,必将发挥越来越重要的作用。


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