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植酸酶的现状及其研究进展

 2014-07-16 15:36:03 浏览量:0

植酸(肌醇六磷酸) 具有强大的络合力,通常与钙、镁、锌、钾等矿物质元素结合,形成不溶性盐类。植酸(盐) 广泛存在于农作物及农



  植酸(肌醇六磷酸) 具有强大的络合力,通常与


钙、镁、锌、钾等矿物质元素结合,形成不溶性盐类。

植酸(盐) 广泛存在于农作物及农副产品中,很多谷

物、油料作物中的植酸含量高达 1 %~3 %,其中钙、

镁、锌、钾等元素以植酸盐的形式存在。因此植酸是

一种抗营养因子,大大降低了微量矿物质的营养有效

性。植酸的这种性质会导致人和动物钙、镁、锌、钾

元素的不平衡性。因此必须在动物的饲料中添加钙

钾等以补充矿物质,这大大提高了饲料成本。同时饲

料中天然磷的含量约为 40 %~70 %,且以植酸磷的形

式存在,而猪、禽的饲料中大量的植酸磷因不能被利

用而从粪便中排出,造成环境污染(磷富集化污染) 。

植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇和磷酸

的一类酶的总称。将植酸酶添加到动物性饲料中释

放植酸中的磷分,不但能提高食物及饲料对磷的吸收

利用率,还可降解植酸蛋白质络合物,减少植酸盐对

微量元素的螯合,提高动物对植物蛋白的利用率及其

植物饲料的营养价值。同时也减少动物排泄物中有

机磷的含量,减少对大自然的污染。

1  植酸酶的作用机理

植酸酶能将肌醇六磷酸(植酸)分解成为肌醇和

磷酸。植酸酶将植酸分子上的磷酸基团逐个切下,形

成中间产物 IP5 , IP4 , IP3 , IP ,终产物为肌醇和磷酸。

不同来源植酸酶作用机理有所不同。微生物产生的 3- 植酸酶作用于植酸时,首先从植酸的第 3 碳位点开

始水解酯键而释放出无机磷,然后再依次释放出其他

碳位点的磷,最终酯解整个植酸分子,此酶需要 2 价

镁离子(Mg

2 +

)参与催化过程。来源于植物的 6 - 植

酸酶,它首先在植酸的第 6 碳位点开始催化而释放出

无机磷。1g 植酸完全分解理论上可释放出无机磷

281. 6mg。植酸酶只能将植酸分解为肌醇磷酸酯,不

能彻底分解成肌醇和磷酸,要彻底分解肌醇磷酸酯,

需酸性磷酸酶的帮助,酸性磷酸酶可以将单磷酸酯、

二磷酸酯彻底分解成肌醇和磷酸。大多数微生物来

源的植酸酶的作用机理如下。

植酸 → D - 1 ,2 ,4 ,5 ,6 - 五磷酸肌醇 + D - 1 ,2 ,3 ,

4 ,5 - 五磷酸肌醇 →1 , 2 , 5 , 6 - 四磷酸肌醇 →1 , 2 ,5 -

三磷酸肌醇或1 ,2 , 6 - 三磷酸肌醇 →1 , 2 - 二磷酸肌

醇 → 2 - 磷酸肌醇

2  植酸酶的种类

植酸酶是一类水解植酸的磷酸酶类,可分为两类

即3 - 植酸酶( EC3. 1. 3. 8) 和 6 - 植酸酶( EC3. 1. 3.

26) 。3 - 植酸酶从3 - 位开始将六磷酸肌醇依次降解

为五、四、三、二、一 - 磷酸肌醇及正磷酸, 6 - 植酸酶

是6 - 位开始将植酸降解,最终产物都是单磷酸肌醇

(2 - 磷酸肌醇)和正磷酸。植物和大肠杆菌植酸酶属

于6 - 植酸酶,而真菌和大多数细菌植酸酶则属于 3

- 植酸酶。对黑曲酶 NRRL3135 菌株的研究表明,该菌产生三种胞外酸性磷酸酶,分别是:6 - 植酸酶即内

消旋肌醇六磷酸磷酸酶( E. C. 3. 1. 3. 8. ) (phyA) ; 3 -

植酸酶即非特异磷酸单酯酶( E. C. 3. 1. 3. 26) (phyB) ;

非特异性磷酸单酯酶,能分解植酸磷的活性成分主要

是phyA。

3  植酸酶的理化特征

3. 1  分子量

植酸酶的分子量因来源不同而差异很大。植酸

酶分子量的差异主要是由于糖基化之故,真菌植酸酶

都是糖基化蛋白,随糖基化程度不同,分子量差异很

大。Markus 等通过对 Aspergillus terreus , Aspergillus

fumigatus , Emericella nidulans , MyceliopHthora

thermopHhila , Talaromyces thermopHilus 及 E. coli (非糖

基化蛋白)等植酸酶进行了研究,发现真菌植酸酶糖

基化模式多种多样,且各不相同,植酸酶基因在不同

的表达系统中,糖基化程度不一样,即使在同一表达

载体时,糖基化程度也不一样,主要是由于潜在的 N

端糖基化位点个数不一样。但糖基化对于酶的专一

性酶活没有多大的影响,而对于酶的分子量和热稳定

性具有显著的影响,对于酶的等电点也有影响。

3. 2  最适pH值

植酸酶的最适 pH 值一般在 2~6 之间。植物来

源的植酸酶最适pH为4. 0~7. 5 ,大多数在5. 0~6. 0 ,

不适合在单胃畜禽酸性的胃中起作用,且在植物中含

量太低。细菌来源的植酸酶最适pH 一般为中性或偏

碱性。真 菌 植 酸 酶 为 2. 5 ~ 7. 0。黑 曲 霉 A.

nigerNRRL3135 产生两种不同的植酸酶,一株最适 pH

值为 5. 5 和 2. 5 ( phyA ) , 另一株最适 pH 为 2. 0

(phyB) 。菌株发酵和生产的植酸酶,经体外试验发

现,在 pH 值为 2. 5 和 5. 5 时活性最强 (Simons 等,

1990) ,pH为2. 5时,与胃中的酸碱度相接近;5. 5时在

小pH 值变化范围内 (Moran1982) 。Newman 等人在

1991年发现由 Aspergillus nigerman 生产的植酸酶在

PH5. 0~6. 5时,具有最强活性。

3. 3  最适温度

植酸酶最适温度在40~60 ℃范围内,不同来源植

酸酶的最适温度相差较大,由于饲料加工都要经过一

个短暂的制粒工艺,在制粒过程中有一个短暂的高温

过程,一般在75~93 ℃。一般的植酸酶活性在此高温

下不可避免的失活。从嗜温微生物 MyceliopHthora

thermopHila、 Aspergillus terreus 等分离到的高温植酸酶

最适温度在 70~80 ℃,虽然有很好的耐温性,但它在

37 ℃(酶作为饲料添加剂最终的作用温度与体温相同)时酶的活性极低,没有使用价值,相反来源于 A.

niger 等在37 ℃时具有较好的酶活性,但它又不能经受

制粒时的高温,所以如何使得酶能短暂的耐高温且在

动物正常体温下具有高酶活性是目前包括植酸酶在

内的饲用酶制剂急需解决的一个问题。一种有效的

方法是研究酶的包被技术,酶在包被衣免受高温的破

坏,包衣在动物胃中可被消化而释放出酶。欧洲的一

种常用方法是把液态植酸酶制剂洒在制成的颗粒料

上,或使用冷压制粒。Simons 等研究了制粒时温度对

植酸酶影响后发现,样品在制粒前蒸汽加热至 50 ℃,

制粒过程达到81 ℃,其酶活性下降 16 %;样品如蒸气

加热至65 ℃,制粒达84 ℃或 87 ℃时,则酶活性分别降

至原来的83 %和46 %。Newman 用 A. niger 生产的植

酸酶作试验表明,将其置于90 ℃环境30min ,其活性不

超过16 %。因此认为植酸酶在正常制粒条件下是较

稳定的,只要在生产中严格控制温度、时间等条件变

化,完全可使酶免受破坏。

3. 4  激活因子与抑制因子

多数二价阳离子( Ca

2 +

、 Fe

2 +

、 Zn2 +

、 Mg2 +

、 Cu2 +

等)因与底物(植酸)发生强烈的络合作用而抑制酶的

活力,草酸、柠檬酸等化合物也因与酶活性中心关键

氨基酸的侧链基因反应而降低酶活,常见的底物竞争

性抑制剂等的出现也会对酶的作用效果产生不利的

影响。对于有的植酸酶,则存在某种特定的金属离子

可以作为电子转移载体起到酶的激活剂的作用,如

Fe

2 +

激活酿酒酵母, Ca

2 +

激活枯草杆菌植酸酶等等。

对于A. niger NRRL3135 phyA , Ca

2 +

、 Fe

2 +

对酶活无影

响,Mn

2 +

、 Co

2 +

有激活作用,能使酶的活性分别提高

30 %和 13 %, Cu

2 +

、 Zn

2 +

、 Fe

3 +

对酶活性具有抑制作

用。另外对一些来源于动物、植物的酸性磷酸酶有抑

制作用的抑制剂如L ( + ) - 酒石酸、磷霉素对它却没

有抑制作用。

4  植酸酶高产菌株的研究进展

天然产植酸酶菌株产酶水平一般较低,无商业开

发价值。目前都是以天然菌株进行改良获得的改良

菌或通过基因工程技术获得的基因工程菌。现在对

无花果曲霉 Asp . ficuum (NRRL31155) 研究的较为详

细。Marisa K. Che - lius 等用紫外照射法对 NRRL3135

菌株进行改良,获得的突变菌株其植酸酶产量为野生

型的3. 3 倍。山西大学生命科学系诸西宁等首次分

离到一种产植酸酶的青霉菌 ———变灰青霉(peicillum

Canescens) ,此菌产酶效果较好,植酸酶活性可达 3.

12U/ g (干曲) 。赵允磷等分离出一黑曲霉菌株(Asp .Niger 70) ,并与国际上公认的植酸酶优良产生菌:无

花果曲霉 NRRL3135 菌株的产酶特性进行了比较,发

现NRRL3135培养8~9d 才达到产酶高峰,而黑曲霉

(Asp . Niger 70)培养5~6d 便可达到产酶高峰;用固态

培养法生产植酸酶的产酶水平前者为 45U/ g (干基) ,

而后者仅为5. 2U/ g (干基) 。陈红歌以黑曲霉 MAO21

(Asp . niger MAO 21)出发菌株,经紫外线、亚硝基胍单

独处理和复合处理,获得一株植酸酶高产菌株UN - l2

- 10 ,发酵108h ,其植酸酶活力达到 2950~3015U/ ml ,

是原始出发菌株的 3. 6 倍。刘德忠以无花果曲霉

2123 - 15 # 为出发菌株,用钴60

照射诱变,获得两株产

植酸酶活力较高的菌株, G - 2123 - 15 - 7 # 和 C2123

- 15 - 64 # ,在最适液态培养条件下,两株菌产酶活

力均在 11. 0U/ ml 以上,最高可达 11. 28U/ ml ,比出发

菌株提高了168. 57 %,发酵时间从9d 缩短到 5d ,缩短

了45 %左右。胥传来等从黑曲霉(Asp· nigur )中筛选

出一株产植酸酶菌,在 30 ℃下恒温培养 4d ,其最高酶

活可达 479. 7U/ ml ,酶的热稳定性较好,温度提高到

55 ℃,酶液仍保持93. 4 %的酶活,温度升到 70 ℃,酶活

尚存87. 7 %。

5  植酸酶活力的测定

植酸酶活性的测定方法较多,但至今尚没有被世

界普遍公认的植酸酶的定量分析方法。

5. 1  钒 - 钼酸铰法

该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放出无

机磷的原理。通过加入酸性钼 - 钒试剂使水解反应

停止,同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应,

形成黄色的钒钼磷络合物,在 415nm 波长下测定磷的

含量。以标准植酸酶为参照物,间接计算被测样品中

植酸酶的含量。本法于1994年列入 AOAC ,我国也已

将此法的测定结果作为审批商品植酸酶注册许可证

和验收进口产品的法定商检依据。

5. 2  硫酸亚铁 - 钼蓝法

该方法利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷

的原理,通过加入三盐酸使水解反应停止,然后加入

钼酸铵及 FeSO4· 7H20的混合液使溶液显色,在 720nm

波长下测定其吸收值,以标准酶为参照物,间接计算

被测样品中植酸酶的含量。

5. 3   Vc - 钼蓝法

该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机

磷的原理,通过加入三氯乙酸使反应停止,然后加入

钼酸铵与Vc 的混合液,使溶液显色,在 820nm 波长下

测定吸光度,再以标准磷溶液的吸光度及磷溶液浓度对应的酶活单位建立直线回归方程,最后以待测样品

吸光度代入方程,计算出酶活性。

5. 4  丙酮 - 磷钼酸铰法

磷酸盐与过量的钼酸铵在酸性条件下混合后,可

慢慢生成黄色磷钼酸铵,加入丙酮后将黄色物质提出

来,在355nm 波长处测吸光度,灵敏度增加10倍。

6  植酸酶的应用

6. 1  食品加工过程中的植酸脱磷

用食品级的植酸酶处理粮食,以分解粮食中的植

酸(盐) ,减少植酸对微量元素的螯合,提高粮食的营

养价值。在大豆加工中可对大豆蛋白进行酶催化改

性,从而提高其营养和商品价值。面包生产过程中添

加植酸酶可以清除揉面中的植酸,面包制作中用的植

酸酶应该是安全无毒,高活性, Ca

2 +

依赖型的,最适

pH应在 4. 5~5. 0 ,并在 30 ℃左右具有高反应速度。

浸渍是玉米浆的生产程序之一,浸渍是为了软化玉米

粒,破碎细胞壁,从而获得玉米浆。微生物植酸酶能

加速这一过程,改良株胚的分离,获得高产量的淀粉

和面筋,并能改善玉米浆的品质。在谷物(玉米、小麦

等)淀粉加工中处理废弃物,降低对环境的污染。

6. 2  饲料添加剂

将植酸酶添加到植物性饲料中,不但能提高植酸

磷的利用率,还可降解植酸蛋白质络合物,减少植酸

盐对微量元素的螯合,提高动物对植物蛋白的利用率

及其植物饲料的营养价值。同时也减少动物排泄物

中有机磷的含量,减少对大自然的污染。

6. 3  生产肌醇磷酸盐或肌醇

利用植酸酶降解米糠等农副产品中所含的植酸

(盐) ,从而生产肌醇磷酸盐或肌醇等产品。

6. 4还用于谷物沉淀加工废弃物的处理。预防由磷缺

乏而引起的各种疾病,促进人畜钙、镁、锌、钾等营养

元素水平的提高。因此植酸酶广泛应用在饲料和粮

食工业,用于降解饲料和食物中的植酸。

7  商品植酸酶研制和商品化过程

早在经典的营养学就指出植酸的害处。自 80 年

代中期,欧洲就致力于寻找全面解决无机磷污染的方

案。而直接的动因是即将在原欧共体成员国实施的

环境保护议会指引(CouncilDirective91/ 676/ EEC) 。核

心内容之一就是限制养殖业的磷排泄量。而荷兰首

当其冲。直到80年后期,荷兰 Wagningen 大学克隆植

酸酶基因出现突破,才有了商业开发的可能。德国巴

斯夫极为重视饲料添加剂领域。30 年来,以优质的产品和对营养学深入的研究及认识处于世界领先的地

位。此时巴斯夫和荷兰的 Gist - brocades (DSM 的前

身)都意识到了植酸酶的潜力,共同开始集中研究进

行商品化开发。率先利用基因转移技术,于1990年首

次成功地用Aspergillusniger 工业化规模生产商品植酸

酶。同年获得欧洲饲料添加剂管理机构的全面批准

认可, 陆续在荷兰、德国等欧洲市场以酶他富

(NatupHos) 为商品名上市。1994 年起在世界各地市

场全面供应酶他富。从这时起,各国以大学、研究所

和各类商业研究机构为主投入了大量的人力物力资

源,开始了大量的研究。90 年代以前,我国在这方面

的研究基本上没有开展。1990 年 6 月,在 Hohenheim

大学纪念门克教授退休暨任教 25 周年的欧洲动物营

养论坛会上,原化工部饲料添加剂开发中心的外派专

家同Dr . Lantzsch 交流植酸和植酸酶时,只谈到了中国

生产大量的肌醇。目前国内至少有 3 - 5 家企业已经

开发出植酸酶产品。还有更多的企业和研究机构正

在从事有关的开发。

8  植酸酶的市场状况

目前我国植酸酶产品主要依赖进口,价格昂贵,

为20万元/吨,从而限制了植酸酶在生产和工业上的

应用。

正因如此,国内各种科研单位都在加强对植酸酶

的开发和研究。国内现有一些科研单位已相继完成

或正在进行这方面的研究。现在国内植酸酶的成本

为5000 元/吨,加上其它消耗在 700 元/吨,而市场上

国产的植酸酶的售价在 2 万元/吨左右。因此每吨植

酸酶的可获利 1. 3 万元。因此植酸酶的利润是可观

的,是可完全替代进口的植酸酶。

1998年中国植酸酶的市场为 5 个亿,2000 年中国

植酸酶市场达 10 个亿。按中国饲料工业的发展规

划,2010 年和 2020 年中国饲料的需求量分别为 1 亿

吨和1. 7亿吨,按千分之一的加酶量算,植酸酶的需

求量应为10万吨和 17 万吨,按 2 万元/吨来计算,那

么其市场应分别为20亿元和34亿元。因此植酸酶具

有良好的市场前景。

9  植酸酶的发展趋势

随着现代分子生物学的飞速发展,采用基因工程

技术手段构建植酸酶基因工程菌,提高酶产量,是植

酸酶研究的新热点。当前国外使用的植酸酶基因工

程菌均是以 NRRL3135 菌株作为出发菌株,如丹麦

NOVO 公司生产的植酸酶就是用该生产菌的基因工

程菌生产的;1991 年荷兰的麦斯特·布罗卜德有限公司在中国申请了专利;微生物植酸酶基因的克隆与表

达,也是以该NRRL3135菌株的基因克隆,并在黑曲霉

中表达的基因工程菌。到目前,共有 10 余个植酸酶

编码基因得到了分离克隆。Van Gorcomd 等构建了 3

组重组 A. niger 菌株,植酸酶产量分别达到 1. 1xl05

U/

ml ,0. 5xl05

U/ ml , 2. 8xl05

U/ ml ,与天然植酸酶产生菌

株不到100U/ ml 相比有大幅度的提高。目前这一菌

株已用来工业化生产。我国姚斌等通过基因工程的

方法获得了高效表达、生产植酸酶的基因工程酵母,

其植酸酶的表达量较天然的植酸酶产生菌黑曲霉高

3000倍以上,有望实现植酸酶的产业化生产。PenJ 等

将带有黑曲霉植酸酶的基因转入烟草种子中得到转

基因种子,植酸酶占成熟种子可溶性蛋白的 1 %,可作

为一种新型饲料添加剂,用以喂仔鸡,生长速度加快,

其效果和添加真菌植酸酶或无机磷相当。Verwoerd

等也做了类似的工作,在转基因烟草中检测到了植酸

酶,其中在叶子中表达量最高,达到可溶性蛋白的 14.

4 %。

10  结束语

植酸酶不仅可以解除植酸的抗营养作用,提高食物和

饲料中多种矿物元素和蛋白质、氨基酸的可利用性,

而且能够降低粪便排泄磷造成的环境污染,是一种新

型的绿色饲料添加剂。通过基因工程技术将高活性

植酸基因转移到高产工业菌株的基因组中,构建高

产、高活性的超级产植酸酶菌株,降低植酸酶的生产

成本,植酸酶的应用必将越来越广泛。


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